?此前，“袁来如此”专栏凭据已宣布的文献资料，对PK定量要领的设计作开端介绍（袁来如此 | 大分子生物剖析概论（十四_上）：LBA定量剖析双特异性生物药的挑战）。本期将延续上期内容，重点就相关案例剖析、庞大药物分子的未来生物剖析技术以及前景等方面进行探讨。
“袁来如此”专栏系广州威廉希尔williamhill医药微信民众号打造的科普学术专栏，内容均为威廉希尔williamhill医药药物研究中心资深科学照料袁智博士原创。
案例剖析（Case studies）
以下案例研究是为了说明关于双特异性分子而言，生物剖析的奇特考虑，其适用于在药物开发的差别阶段设计和实施定量生物剖析和PK评估。
案例剖析1：在非临床研究中定量总和完整双特异性药物并评估ADA对PK的影响。
化合物X是一种基于支架的针对两种细胞因子的双特异性抗体。开端数据标明，这种特殊的支架产品平台可以在非临床物种中高频率地诱导免疫原性。为了更好地解释ADAs保存时的毒理学发明，生物剖析小组决定开发两种差别的PK要领来测定动物血清中的总药物和完整药物的浓度。总PK要领是使用两种抗体对支架的框架进行剖析。完整的PK要领是使用一种靶向细胞因子作为捕获试剂，另一种作为检测试剂�？梢允硬斓�，使用两种PK要领剖析相同的样品爆发的浓度与时间关系险些完全等同，除了在较晚的时间点之外，药物浓度很是低的时候，即完整药物浓度略低于总药物浓度的时候。
在这些时间点视察到的低浓度差别只爆发在少数受试者上。因此，ADA和生物转化（biotransformation）被认为是最可能的基础原因。需进行一项研究以确定这种差别的基础原因，如生物转化诱导的不稳定性，靶标滋扰（target interference）和ADA滋扰。为了验证这种双特异性分子的体内生物转化，例如，卵白质水解是否揭示了影响稳定性的结构缺陷，故开发了两种配体结合质谱(ligand-binding mass spectrometry，LBMS)要领，使用抗人Fc免疫亲和捕获和靶目标捕获，然后进行分条理的质谱剖析。接纳与ESI-MS相结合的纳米级液相色谱法对非多种代谢产品进行了更高区分率的疏散和鉴定。
数据显示，生物转化的结果为阴性。ADA剖析标明双特异性分子比其母体药物的ADA泛起频率更高。尽管随后通过免疫原性表征，证实大大都ADAs并非中和性ADAs，但发明ADAs有助于快速地清除完整药物。这些数据也可以解释为当药物浓度足够低时，内源性细胞因子占据了特定的捕获/检测位点，即保存靶标滋扰。结果标明，该药物在体内结构稳定。PK数据差别与完整药物的不稳定性无关，而更可能是由于ADAs高水平导致清除药物的速度更快。
案例剖析2：一个F(ab’)2在体内生物转化为两个活性F(ab)单体的PK剖析。
本案例研究涉及一个双特异性F(ab’)2，由一个anti-VEGF arm和一个anti-Ang2 arm组成，用于玻璃体内注射（intravitreal administration）治疗视网膜变性疾病，如湿性老年性黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿。据报道，针对F(ab’)2抗体铰链区的，先前保存的内源性抗体(PEA)保存于很大比例的人群中。在未接受药物的食蟹猴和人血清样本中，都证实了这一点。移除这些预先保存的内源性抗体的铰链表位（hinge epitopes）使得该分子中只有单个二硫键将两个fab结合在一起。
因此，注射入玻璃体（其含有glutathione作为抗氧化产品的一部分，以包管晶状体的完整性）后，药物分子生物转化为individual Fabs，相关清除率(t1/2 <1天)，通常比兔玻璃体的Fab (t1/2 约3天)或F(ab’)2 (t1/2 约3天)的清除率要大(未宣布的视察结果)。
备注：一般情况下，t1/2与清除率的关系如下，即半衰期还取决于药物漫衍体积；如果假设漫衍体积恒定，则t1/2与清除率之间的关系是确定成反比的：
因此，完整的F(ab’)2和individual Fab碎片均保存于眼腔(玻璃体和水相之中)和系统循环之中。正如所预料的，啮齿类动物脉络膜新生血管模型（rodent choroidal neovascularization models）显示，individual Fabs保存了生物活性。为了全面地描述活性药物袒露量的特征，有须要定量这3种药物形式。因此，开发并验证了3种单独的PK定量要领。此前有学者一经考虑过使用一种总PK定量要领来测定所有这3种形式。可是，该分子是一个新颖结构，故有须要剖析其生物转化的动力学，这关于描述该分子体内的行为是很重要的。
定量完整待测物的ELISA要领使用牢固的（immobilized）重组卵白Ang2捕获待测物，然后加入biotin-VEGF，最后加入streptavidin-HRP，是一个sequential sandwich花样。外加待测物的接纳率实验证明这种测试花样仅能够特异性地检测F(ab’)2，但检测不到两种Fab分子中的任何一个。定量两个Fab分子的要领都接纳类似的基本花样：使用各自的靶标-Ang2或靶标-VEGF，从样本中捕获Fabs。然后加入biotin-sheep antihuman IgG的重链和轻链(H&L)，最后，加入streptavidin-HRP进行检测。
值得注意的是，接纳测定Fab的花样，也可以检测到完整分子。尽管使用Fabs作为标准品（standards）和比照品（controls），在剖析Fab时，也定量了完整F(ab’)2。别的，使用F(ab’)2和任何一个Fab的混淆物，可以通过从完整分子（高特异性）的定量结果中减去Fab结果来定量另一个Fab。已经验证了所有这些剖析要领，并用于兔血清样本的非临床研究，也认证了这些要领可用于食蟹猴的血清和水/玻璃体/视网膜的萃取物中药物的定量。血清定量剖析的另一个挑战是几个ng/ml甚至更低的药物浓度，这也是玻璃体腔生物药给药的一致特点：给药量很小(通常是<1 mg/eye)；药物在抵达系统循环时，经历了高倍数的稀释。
案例剖析3：在非临床研究中监测体内双特异性药物生物转化的总和活性（total and active）药物的定量。
一个针对肿瘤适应症的双特异性单克隆抗体靶向两个细胞外貌的抗原，其药理作用取决于单克隆抗体的两个结合臂（both binding arms）的完整。然而，在体外生物物理表征历程中，在其中一个结合臂中发明了翻译后修饰(post-translational modification，PTM)的问题。但这种PTM，不可在不显著损害生物活性的情况下，通过卵白质工程而排除，因为在不稳定的氨基酸上的点突变（point mutation）会完全破坏单抗与靶标的结合。别的，仅具有第二个结合臂功效的药物变异体的累积，可能会屏蔽活性药物结合第二个靶点，并可能在多次给药后诱发毒性反应。
对该单抗体内生物转化的特征进行研究是势在必行的，如转化的动力学和水平，这可以为进一步开发该单抗提供指导。随后，使用与分子的Fc部分特异性结合的测试试剂开发了一个桥接花样的总药物PK定量要领，辅之以一种活性药物PK定量要领：纵然用靶标卵白作为PTM-liable functional domain的捕获试剂，使用抗人Fc试剂作为检测试剂。利用野生型和拥有点突变的药物的混淆比例，活性PK要领，在总药物保存的情况下，能够区分和准确测定活性药物的百分比。之后，评估了该药物分子在食蟹猴上的PK特性。使用了总和活性PK定量要领来测定研究样本中总和活性药物的浓度。实验数据证实，体内样品中的药物泛起了PTM，并且活性药物浓度百分比随时间而降低�；诮：头抡�，可以在临床研究中减少剂量间隔来减轻活性药物浓度的降低。非临床研究结果有助于决定使用活性PK定量要领作为支持临床研究的主要要领。而在FIH研究中，总PK定量要领可用于进一步描述无活性药物变异体（inactive drug variants）潜在的累积及其对PK/PD和毒性的影响。
庞大药物分子的未来生物剖析技术
如表1中所总结的，一般需要多种PK定量要领和ADA要领评估ADC和双特异性抗体的基础药代动力学和免疫原性。剖析要领数量的增加给样本的收集、贮存、运输、剖析和剖析要领的生命周期治理带来了巨大的担负。在某些情况下，由于样本数量有限，基础不可能进行多次剖析。关于增加的功效域和潜在的生物转化，仅仅增加剖析要领的数量以满足生物剖析需求似乎是一个直接的解决计划，但“两点式two-point”结合要领（如夹心式LBA）并不适合评估具有多域（>3）结构的分子“完整性intactness”。尽管免疫捕获（IC-）-LC-MS/MS要领在理论上可以识别来自多个功效域的特征肽，但有关“完整性”和功效的信息仍然缺失。因此，随着庞大药物模式（complex drug modalities）的生物转化越来越受到的关注，定量LBA要领和（IC-）LC-MS/MS要领往往无法对潜在的生物转化提供相关信息。正如CovX-Body和基于框架（scaffold-based）的双特异性抗体的案例所标明的那样，PK行为的意外纷歧致触发了潜在生物转化的嫌疑，进而就需要新的剖析要领来进一步研究。
表1.ADC和双特异性抗体的PK定量要领（SCR，标准曲线规模；ECL，电化学发光；N.A.，不适用）
备注：表格中参考文献的标注不适用。
因此，使用multiplexed PK/ADA要领以测定完整药物、种种变构体（variants）和相关的ADA是很是需要的，同时，也对潜在的生物转化提供相关信息。Multiplexed检测要领已在联合疗法中有早期应用，但尚未看到对庞大药物模式“biotransformation ready”的multiplexed测试要领，用以资助评估庞大药物的完整性，表征种种生物转化，并测试对药物/药物变构体各部分的免疫反应。下文将简单介绍对庞大药物模式有希望的两项生物剖析技术：HR-MS定量剖析完整卵白质和毛细管Western Blot定量剖析。
HR-MS 定量剖析完整卵白质
与针对完整药物分子中某个选定区域的LBA和LC-MS/MS技术相比，完整卵白质的定量剖析旨在将一个庞大的药物分子作为一个整体来研究，这能够揭示重要的高条理结构和生物转化的相关信息。完整卵白的LC-MS剖析通常用作对生物转化研究的定性剖析。Murphy等人使用IC-LC Q-ToF MS，在CovX-Body双特异性抗体上发明并鉴别了卵白酶剪切掉的含有8个氨基酸的肽段。He等人利用高区分率的QTOF-MS与IC-LC相结合，乐成地在小鼠血浆中，鉴别了若干差别DARs的ADC和生物转化了的变异体（biotransformed variants，由于增加/删除了hexose, glutathione, cysteine以及linker-drug）。近年来，HR-MS在灵敏度和质量区分率方面的提高，逐渐使其在定量生物剖析中得以有更广泛的应用。
Jian等人建立了IC-LC-QTOF-MS的事情流程，用于小鼠血浆中人类mAbs的绝对定量。定量的下限（LLOQ）为1000ng/mL（20 ?L血浆样品），并可降至250ng/mL，如果使用200?L样品。在优化其数据处理战略后，LLOQ降至50ng/mL。使用所述事情流程，Jian等人随后展示了GLP1-Fc融合卵白的定量；同时，在对小鼠的研究历程中，识别了该药物的两种主要卵白酶降解产品。
Lanshoeft等人验证了基于multiplex IC-LC-HRMS的PK定量要领，并用于非临床PK研究，该要领同时定量剖析了大鼠血清中两个人类IgG1。类似地，Jin等人在大鼠血清中定量了完整的trastuzumab emtansine（一种ADC）及其主要的DAR物种，其定量下限值约为20ng/mL，线性动态规模为5-100?g/mL。
另一个有趣的应用是最近Zhang等人报道的，在非变性LC条件下对native intact mAb进行的定量剖析，这可能为使用LC-HR-MS技术以multiplex的方法建立结合（bound）/未结合（unbound）PK定量要领以及其它种种功效域PK的定量要领提供了时机。
毛细管Western Blot定量剖析要领
毛细管Western blot，也称为毛细管纳米免疫测定（capillary nanoimmunoassay，CNIA），已由制造商Protein Simple(San Jose, CA)商业化的Simple Western system，是指毛细管电泳免疫测定系统，它提供基于卵白质巨细和电荷的疏散花样。与在疏散和检测之前进行配体结合的IC-LC-MS技术差别，Western blot首先疏散卵白质，然后使用配体结相助为检测要领。因此，它能够使用multiplexed immunoassay，同时检测完整的卵白质及其生物转化的产品，并对变异的种种功效域进行表征。
目前，毛细管Western Blot定量剖析在卵白质药物的PK研究中应用仍然有限。Li等人在小鼠研究中验证了无浓缩的PK要领，以定量小鼠血浆中的polyhistidine N-和FLAG C-terminally-tagged重组卵白（约55kDa），其LLOQ为20ng/mL。Anti-FLAG tag抗体在immunoblot办法中用作初级抗体。研究发明，只需以1:100至1:500的比例稀释样品，即可消除基质中高品貌卵白的滋扰。
别的，Kodani等人使用capillary western blot检测到丙型肝炎病毒（HCV）的IgG抗体，标明其在抗药物抗体（ADA）检测方面的潜在应用。重组HCV卵白首先在毛细管中疏散和牢固。稀释的人类血清随后在毛细管中孵育，使抗HCV抗体与牢固的抗原结合。这一办法之后，使用抗人类IgG-HRP抗体再进行第二次孵育。在70个特表征良好的人血清样本的检测中，该要领与另一种市售的抗HCV抗体测试要领的相关性良好。
结论
为了解决双特异性分子开发历程中所需的生物剖析支持，本文讨论了在开发这些药物分子的PK剖析战略时一些奇特的考虑。本文提出的战略和要领可以应用于双特异性分子和其它多域大分子药物，这需要对特定的药物分子其作用机制（MOA）和潜在的靶标生物学，以及评估PK/PD的所需要的数据有全面的了解。
大分子生物剖析行业需要新的定量剖析技术来开发multiplexed PK定量要领，以便定量庞大模式的药物及其生物转化产品。用于完整卵白质剖析的（IC-）LC-HR-MS和capillary Western blot技术拥有很大应用前景，因其multiplexibility和提供目标待测物的多维信息（如分子量等电点和域功效/domain functionality）的能力。在已往几年中， HR-MS和capillary Western blot platforms的定量灵敏度有了显著改善，尽管这些技术仍需要进一步改善，以获得更广泛的接受。目今HR-MS系统的一般操作相对简单，但HR-MS（以及capillary Western blot）的数据剖析、解释和验证，从监管的角度看，还需要进一步明确。
从理想的和雄心勃勃的角度思考，最好将PK/PD/免疫原性/生物转化的生物剖析整合到一个剖析测试要领之中，以减少药物开发所需的资源，并增进在同一组患者样本中全面剖析药物的PK/PD行为。设计和开发这样的定量剖析的要领，对每一种生物药结构都是奇特的，需要一种彻底的“适合其用途”的要领及其确认（confirmation）。为双（多）特异性分子开发可靠、稳健和可重现的PK剖析要领是很是具有挑战性的，因为多种因素会影响准确（accurate）而有意义（meaningful）的浓度测定值。未来生物剖析行业和监管机构对指导定量剖析这些高度庞大的生物（卵白）药的最佳做法的讨论和意见，将会极具价值。
未来前景
随着生物剖析要领的特异性、选择性和灵敏度的不绝提高，更准确（accurate）和更精密（precise）的测定双特异性抗体浓度和评估其在生物样品中的免疫原性将成为可能。预计双特异性和多特异性生物药的数量和种类将继续扩大，这将增进新的生物剖析要领的开发，以适应这些分子的结构庞大性和MOAs。
虽然，目前的要领将被用于新的卵白药物的定量。尽管LBA要领是目前生物剖析要领的首要选择，并且在可以预见的未来仍将如此，LC-MS/MS要领，由于其与生俱来的multiplexed的定量剖析能力，可能会获得越发广泛地应用，以支持双特异性生物药的PK评估。LC-MS/MS比LBA剖析具有更少的剖析变异性（variability）和要害试剂的可及性（availability）问题。预期剖析实验室的自动化将扩展到生物剖析的所有阶段，以减少人工过失和提高数据质量。
特别声明
本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经宣布学术期刊、官方网络报道等果真渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备�＝哟琳咛峁┯屑壑档奈南准捌淦拦�。
参 考 文 献
1.Zhu, L, et al. (2020). "Bioanalytical Challenges in Support of Complex Modalities of Antibody-Based Therapeutics." AAPS J 22(6): 130.
2.Ma, M., et al. (2019). "Bioanalytical challenges and unique considerations to support pharmacokinetic characterization of bispecific biotherapeutics." Bioanalysis 11(5): 427-435.
3.Seimetz D. Novel monoclonal antibodies for cancer treatment: the trifunctional antibody catumaxomab (removab). J. Cancer 2, 309–316 (2011).
4.Mullard A. Bispecific antibody pipeline moves beyond oncology. Nat. Rev. Drug Discov. 16(11), 666–668 (2017).
5.Diao L, Meibohm B. Tools for predicting the PK/PD of therapeutic proteins. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 11(7), 1115–1125 (2015).
6.Trivedi A, et al. Clinical pharmacology and translational aspects of bispecific antibodies. Clin. Transl. Sci. 10(3), 147–162 (2017).
7.Ezan E, et al. Assessment of the metabolism of therapeutic proteins and antibodies. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol.10(8), 1079–1091 (2014).
8.Fischer SK, et al. The assay design used for measurement of therapeutic antibody concentrations can affect pharmacokinetic parameters. Case studies. MAbs 4(5), 623–631 (2012).
9.Ruf P, et al. Pharmacokinetics, immunogenicity and bioactivity of the therapeutic antibody catumaxomab intraperitoneally administered to cancer patients. Br. J. Clin. Pharmacol. 69(6), 617–625 (2010).
10.Samineni D, et al. Impact of shed/soluble targets on the PK/PD of approved therapeutic monoclonal antibodies. Exp. Rev. Clin. Pharm. 9(12), 1557–1569 (2016).
11.Villegas VM, et al. Current advances in the treatment of neovascular age-related macular degeneration. Expert Opin. Drug Deliv. 14(2), 273–282 (2017).
12.Ruppel J, et al. Preexisting antibodies to an F(ab’)2 antibody therapeutic and novel method for immunogenicity assessment. J. Immunol. Res. 2016, 1–8 (2016).
13.Fan X, et al. Lens glutathione homeostasis: discrepancies and gaps in knowledge standing in the way of novel therapeutic approaches. Exp. Eye Res. 156, 103–111 (2017).
14.Kang L, et al. LC-MS bioanalysis of intact proteins and peptides. Biomed Chromatogr. 2020;34(1):e4633. https://doi.org/10.1002/bmc.4633.
15.Chen, J, et al. "Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics." Journal of translational medicine 13: 182. (2015)
16.Murphy RE, et al. Combined use of immunoassay and twodimensional liquid chromatography mass spectrometry for the detection and identification of metabolites from biotherapeutic pharmacokinetic samples. J Pharmaceut Biomed.2010;53(3):221–7. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.04.028.
17.He JT, et al. High resolution accurate-mass mass spectrometry enabling in-depth characterization of in vivo biotransformations for intact antibody-drug conjugates. Anal Chem. 2017;89(10):5476–83.https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b00408.
18.Jian WY, et al. A workflow for absolute quantitation of large therapeutic proteins in biological samples at intact level using LC-HRMS. Bioanalysis.2016;8(16):1679–91. https://doi.org/10.4155/bio-2016-0096.
19.Lanshoeft C, et al. Generic hybrid ligand binding assay liquid chromatography high resolution mass spectrometry based workflow for multiplexed human immunoglobulin G1 quantification at the intact protein level: application to preclinical pharmacokinetic studies. Anal Chem. 2017;89(4):2628–35. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b04997.
20.Jin W, et al. LC-HRMS quantitation of intact antibody drug conjugate trastuzumab emtansine from rat plasma. Bioanalysis. 2018;10(11):851–62. https://doi.org/10.4155/bio-2018-0003.
21.Zhang LY, et al. Top-down LC-MS quantitation of intact denatured and native monoclonal antibodies in biological samples. Bioanalysis. 2018;10(13):1039–54. https://doi.org/10.4155/bio-2017-0282.
22.Li Y, et al. An efficient and quantitative assay for epitope-tagged therapeutic protein development with a capillary western system. Bioanalysis. 2019;11(6):471–84. https://doi.org/10.4155/bio-2018-0248.
23.Kodani M, et al. An automated immunoblot method for detection of IgG antibodies to hepatitis C virus: a potential supplemental antibody confirmatory assay. J Clin Microbiol. 2019;57(3). https://doi.org/10.1128/JCM.01567-18.
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